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PCR Master Mix 光速计算小技巧

PCR Master Mix 是一种预混有 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、氯化镁和反应缓冲液的即用型溶液。做 PCR 实验的时候,用 Master Mix 既可以减少移液器的繁琐操作,又可以降低污染风险。而且,Master Mix 更加方便快捷,可以提升准备 PCR 实验的效率,是一种高吞吐量(high-throughput)应用的理想选择。虽然 Master Mix 在 ThermoFisher 和 SigmaAldrich 这种网站可以直接购买,但是在实验室自制 Master Mix 是一种更加经济实惠的选择。

准备好 Master Mix 之后,加入 DNA 样本即可进行反应,非常方便快捷。

回顾一下什么事 PCR

PCR,也就是聚合酶链式反应,用于扩增(amplify)特定的 DNA 序列,供下游实验使用。

PCR 的发明者 Kary Mullis 的 PCR 专利于 1987 年获得批准,并且在六年后被授予了诺贝尔化学奖。从那以后,在分子生物学技术之中,PCR 一直都是非常重要的技术之一。

PCR 的应用场合非常多,比如说遗传工程、基因分型、测序,甚至家族关系的鉴定。可以说没有 PCR,很多事情都将变得不可能。

想要高效进行 PCR 反应,就需要准备一个 Master Mix,加入模板 DNA,并使用热循环仪扩增样本序列。

Master Mix 的挑战

进行一个 PCR 反应看似很简单,但事实并不是这样。

第一个挑战应该是计算所需的试剂的数量。一部分文献在描述他们的实验步骤的时候,不会用 uL 做单位,而是 mM 或者 uM。这固然是好的,因为这样可以用更精简的语言描述实验。不过,当我在重复这些实验的时候,就需要正确计算所需的主混合物试剂的数量,从而获得正确的体积和正确的浓度。不得不说,对于第一次做这个实验的人,可能这个步骤还是比较麻烦的。不过熟能生巧,做的多了就会秒出结果。

第二个挑战可能是把这些试剂混合到一起的过程。在制作 Master Mix 的时候,一般是要在 4ºC 的条件下混合这些试剂的。而且,在进行 PCR 实验的时候,通常都是用非常少量的试剂,所以必须要集中注意力。但凡有一点点分心,可能就不知道哪个试剂是哪个试剂了……也很容易发生跳管或跳孔等错误,尤其是在用单道移液器的时候,所以要多加注意。

最后的挑战应该是确保 PCR 反应不受污染。这点非常重要,因为 PCR 是非常敏感,它可以从极少量的 DNA 样本里复制大量 DNA,因此扩增子和样品污染很有可能会成为一个巨大的问题。

Master Mix 的计算

这篇博客主要讲的还是一个 Master Mix 的快速计算。我的习惯是做一个下面这样的表格。首先我们假设每个 PCR 反应的体积是 50 uL,然后我要做六个 PCR 实验(四个样本+阴性和阳性对照)。

ReagentStockFinalDilution FactorVolume (50 uL) / Rxn6 + 1 rxns
Buffer5x1x510.070.0
MgCl250 mM1.5 mM33.31.5010.5
ITS120 uM0.5 uM401.258.75
ITS420 uM0.5 uM401.258.75

计算时尤其要注意原液浓度。不同的公司有不同的浓度。

可以先做一个上面的那种表格,然后填写反应缓冲液、氯化镁和引物的原液浓度(Stock)和期望的最终浓度(Final)。尤其要注意原液浓度,因为不同的公司可能会使用不同的浓度。

然后,用原液浓度除以最终浓度,计算出稀释系数(Dilution Factor)。

最后,为了确定每个试剂所需的液体体积,要用所需的总反应体积除以稀释系数。

另外,因为我们要做 6 个 PCR 反应,所以我们把每个反应所需液体的体积乘以 6 + 1。之所以 +1 是因为为要起到一个保险的作用,防止实验过程出错。也就是说我们实际上有 7 个 PCR 反应所需的 Master Mix 体积。

以及因为 dNTPs 会决定热循环仪循环次数的意义,所以在我目前进行的项目里,每个 PCR 反应我通常会加 1 uL 的 10 mM dNTPs。

总之,最后每个 PCR 反应所需要的试剂体积如下:10.0 uL 反应缓冲液 + 1.50 uL 氯化镁 + 1.25 ITS1 + 1.25 ITS4 + 1 uL dNTPs = 15 uL 总试剂体积。

酵母菌群 PCR

我个人项目的实验对象是一种酵母。由于某种原因,这种酵母的生长速度非常缓慢,所以用通常的 DNA 提取法并不能取得比较适合后续实验的 DNA 浓度,因此需要进行菌群 PCR。

我会先准备好上面的 Master Mix,把它分成六份,分别放在六个 PCR 管里。

刚才我们假设了每个 PCR 反应的体积是 50 uL,但是我们只有 15 uL 的试剂,所以我们要往每个 PCR 管里放 34 uL MiliQ 纯水。记得用紫外线消毒来确保纯水的纯度。

为什么是 34 uL 呢?因为剩下的 1 uL 体积是留给菌群的。

掏出之前提前培养好的酵母菌群,用无菌的 20 uL 移液器头碰一下酵母菌落,把菌群直接放入装有 Master Mix 的 PCR 管里。这时候 Master Mix 应该略显混浊,但不致于有大量的细胞。

这时候 PCR 实验就算准备好了。只需要把 PCR 管扔到热循环仪里就万事大吉了!

设置好热循环仪器,进行一个循环

后记

PCR 是分子生物学里最常用的基本技术。但它经常涉及到移取棘手的、极少的试剂量,因此可能很难获得理想的结果。另外,PCR 是一种非常敏感的检测方法,污染可能对结果产生巨大的影响,所以操作过程中一定要注意不能有污染。

此处所记的内容仅供个人参考。

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